水泡性口炎病毒G蛋白与LGALS1的相互作用研究

【摘要】水泡性口炎病毒（Vesicularstomatitisvirus,VSV）是一种非节段的反义RNA病毒，属于弹状病毒科（Rhabdoviridae）水泡病毒属（Vesiculovirus）。其天然宿主有牛、猪、马和其他哺乳动物以及它们的昆虫媒介。VSV感染动物后特征性临床表现为舌、唇、口腔黏膜、蹄冠部和乳头上皮出现水疱和溃疡，与口蹄疫、水疱疹、猪水泡病等极为相似，因此，在兽医临床诊断上极易误诊。此外，VSV还可以感染人，轻者引起口唇水泡和流感样症状，严重的可导致病毒性脑炎。因此，该病毒感染具有重要的公共卫生学意义。VSV吸附和入侵宿主细胞主要由表面的糖蛋白G介导，G蛋白是病毒感染力的决定性抗原，具有刺激机体产生中和抗体的作用。G蛋白通过结合宿主细胞表面受体，直接影响着病毒吸附宿主细胞的过程以及病毒的出芽。尽管针对VSV的受体研究有一些文献资料，但VSV-G蛋白的受体尚未确定。因此，开展VSV-G蛋白互作蛋白的研究将对其受体的确定、病毒的侵染过程及致病机制等都具有重要的意义。在前期研究中，以VSV-G为诱饵，利用酵母双杂交方法从MDBK细胞的cDNA文库中筛选出VSV-G的互作蛋白半乳糖凝集素1（lectingalactoside-bindingsoluble1,LGALS1），并通过pull-down实验进行了初步的验证。本研究在此基础上，将VSV-G全基因插入到pEF1a-IRES-DsRed-Express2真核表达载体中，构建了pEF1α-VSV-G重组质粒；双酶切和PCR的鉴定结果证实了该重组质粒的正确性；将pEF1α-VSV-G转染至BHK-21细胞中，24h后进行的荧光检测结果可见蛋白表达后发出的红色荧光；Westernblot对细胞总蛋白中VSV-G蛋白的检测结果显示出与预期目的蛋白大小一致的条带，说明VSV-G蛋白在细胞内成功表达。同时，本研究将LGALS1基因插入到pEGFP-N1真核表达载体中，构建了pN1-LGALS1重组质粒并进行了鉴定。将双酶切及PCR方法鉴定正确的重组质粒转染BHK-21细胞24后进行荧光检测，可见有明显的绿色荧光出现；Westernblot检测结果显示，转染重组质粒的细胞中LGALS1的表达量明显高于转染空载体的细胞内LGALS1的表达量，说明该基因在细胞中成功表达。在上述两个基因成功表达的基础上，本研究利用间接免疫荧光方法对LGALS1与VSV-G在MDBK细胞中的相互作用进行了定位分析，可见红色与绿色荧光重叠后形成的黄色荧光，初步证明二者发生了相互作用；通过免疫共沉淀实验，用兔抗VSV-G抗体分别对共转染pEF1α-VSV-G和pEGFP-N1重组质粒的BHK-21细胞和单独转染pEGFP-N1重组质粒的BHK-21细胞的总蛋白中的VSV-G蛋白及其结合蛋白进行筛选，并用Westernblot对筛选的蛋白进行检测。结果显示，前者同时检测到VSV-G和LGALS1蛋白，而后者并未检测到VSV-G或LGALS1蛋白，进一步验证了VSV-G与LGALS1能够发生结合。将不同质量的LGALS1预先与VSV作用后，再接种MDBK细胞，观察LGALS1对病毒的抑制效果。结果显示，随着与VSV结合的LGALS1增多，细胞的病变情况逐渐减轻，而且过量的LGALS1能够阻碍VSV对细胞的感染。用一定量的VSV接种MDBK细胞，荧光定量PCR检测细胞中LGALS1的变化，结果显示LGALS1基因的表达量在VSV感染细胞后显著上升。综合以上实验结果，本研究确定LGALS1可以与VSV-G蛋白发生相互作用，而且LGALS1在VSV感染细胞过程中充当受体的角色，其表达水平与VSV的复制水平呈正相关。本研究结果不仅为深入探讨VSV所致的水泡性口炎发病机制奠定基础，有助于揭示病毒的感染途径和复制过程等一系列分子致病机制问题，而且将可为利用鉴定获得的受体蛋白研制新的预防和治疗制剂提供物质基础。
【作者】王丽；
【导师】高丰；
【作者基本信息】吉林大学，基础兽医学，2014，硕士
【关键词】水泡性口炎病毒；G蛋白；LGALS1；真核表达；蛋白互作；

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